Методы исследования цитологии и гистологии. Введение методы исследования в гистологии цитологии и эмбриологии
Гистология – («гистос» греч. – ткань, логис - учение) Это наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей многоклеточных организмов и человека. Невооруженному глазу недоступны объекты, являющиеся предметом этой науки. Поэтому и история гистологии тесно связана с истроией создания таких приборов, которые позволяют изучить мельчайшие предметы, невооруженным глазом. 2
Курс гистологии условно разделен на следующие разделы: n 1. Цитология - наука о клетке. n 2. Эмбриология - наука о развитии, от зарождения до полного формирования организма. n 3. Общая гистология - наука об общих закономерностях, присущих тканям. n 4. Частная гистология - изучает строение, развитие органов и систем.
ЦИТОЛОГИЯ – (греч. κύτος «клетка» и λόγος - «учение» , «наука») n Раздел биологии, изучающий живые клетки, их органоиды, их строение, функционирование, процессы клеточного размножения, старения и смерти. 4
ЭМБРИОЛОГИЯ n (от др. -греч. ἔμβρυον - эмбрион, зародыш + -λογία от λόγος - учение) - это наука, изучающая развитие зародыша. 5
История создания клеточной теории 1590 год. Янсен изобрел микроскоп, в котором увеличение обеспечивалось соединением двух линз. 1665 год. Роберт Гук впервые употребил термин клетка. 1650 -1700 годы. Антони ван Левенгук впервые описал бактерии и другие микроорганизмы. 1700 -1800 годы. Опубликовано много новых описаний и рисунков различных тканей, преимущественно растительных. 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих. 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. 1838 -1839 годы. Ботаник Матиас Шлейден и зоолог Теодор Шванн объединили идеи разных ученых и сформулировали клеточную теорию, которая постулировала, что основной единицей структуры и функции в живых организмах является клетка. 1855 год. Рудольф Вирхов показал, что все клетки образуются в результате клеточных делений.
История создания клеточной теории 1665 год. Рассматривая под микроскопом срез пробки, английский ученый, физик Роберт Гук обнаружил, что она состоит из ячеек, разделенных перегородками. Эти ячейки он назвал "клетками"
История создания клеточной теории В XVII столетии Левенгук сконструировал микроскоп и открыл людям дверь в микромир. Перед глазами изумленных исследователей замелькали разнообразнейшие инфузории, коловратки и прочая мельчайшая живность. Оказалось, что они повсюду – эти мельчайшие организмы: в воде, навозе, в воздухе и пыли, в земле и водосточных желобах, в гниющих отходах животного и растительного происхождения.
История создания клеточной теории 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. В 1838 г. немецкий ботаник М. Шлейден привлек внимание к ядру, считал его образователем клетки. По Шлейдену, из зернистой субстанции конденсируется ядрышко, вокруг которого формируется ядро, а вокруг ядра - клетка, причём ядро в процессе образования клетки может исчезать.
История создания клеточной теории Немецкий зоолог Т. Шванн показал, что из клеток состоят и ткани животных. Он создал теорию, утверждающую, что клетки, содержащие ядра, представляют собой структурную и функциональную основу всех живых существ. Клеточная теория строения была сформулирована и опубликована Т. Шванном в 1839 г. Суть её можно выразить в следующих положениях: 1. Клетка – элементарная структурная единица строения всех живых существ; 2. Клетки растений и животных самостоятельны, гомологичны другу по происхождению и структуре. Каждая клетка функционирует независимо от других, но вместе со всеми. 3. Все клетки возникают из бесструктурного межклеточного вещества. (Ошибка!) 4. Жизнедеятельность клетки определяется оболочкой. (Ошибка!)
История создания клеточной теории В 1855 г. немецкий врач Р. Вирхов сделал обобщение: клетка может возникнуть только из предшествующей клетки. Это привело к осознанию того факта, что рост и развитие организмов связаны с делением клеток и их дальнейшей дифференцировкой, приводящей к образованию тканей и органов.
История создания клеточной теории Карл Бэр Еще в 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих, доказал, что развитие млекопитающих начинается с оплодотворенной яйцеклетки. Значит развитие любого организма начинается с одной оплодотворенной яйцеклетки, клетка является единицей развития.
История создания клеточной теории 1865 г. Опубликованы законы наследственности (Г. Мендель). 1868 г. Открыты нуклеиновые кислоты (Ф. Мишер) 1873 г. Открыты хромосомы (Ф. Шнейдер) 1874 г. Открыт митоз у растительных клеток (И. Д. Чистяков) 1878 г. Открыто митотическое деление животных клеток (В. Флеминг, П. И. Перемежко) 1879 г. Флеминг – поведение хромосом во время деления. 1882 г. Открыт мейоз у животных клеток (В. Флеминг) 1883 г. Показано, что в половых клетках число хромосом в два раза меньше, чем в соматических (Э. Ван Бенеден) 1887 г. Открыт мейоз у растительных клеток (Э. Страсбургер) 1898 г. Гольджи открыл сетчатый аппарат клетки, аппарат Гольджи. 1914 г. Сформулирована хромосомная теория наследственности (Т. Морган). 1924 г. Опубликована естественно-научная теория происхождения жизни на Земле (А. И. Опарин). 1953 г. Сформулированы представления о структуре ДНК и создана ее модель (Д. Уотсон и Ф. Крик). 1961 г. Определены природа и свойства генетического кода (Ф. Крик, Л. Барнет, С. Беннер).
Основные положения современной клеточной теории 1. Клетка - элементарная живая система, единица строения, жизнедеятельности, размножения и индивидуального развития организмов. 2. Клетки всех живых организмов гомологичны, едины по строению и происхождению. 3. Образование клеток. Новые клетки возникают только путем деления ранее существовавших клеток. 4. Клетка и организм. Клетка может быть самостоятельным организмом (прокариоты и одноклеточные эукариоты). Все многоклеточные организмы состоят из клеток. 5. Функции клеток. В клетках осуществляются: обмен веществ, раздражимость и возбудимость, движение, размножение и дифференцировка. 6. Эволюция клетки. Клеточная организация возникла на заре жизни и прошла длительный путь эволюционного развития от безъядерных форм (прокариот) к ядерным (эукариотам).
МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 1. Световая микроскопия. 2. Ультрафиолетовая микроскопия. 3. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. 4. Фазово-контрастная микроскопия. 5. Микроскопия в темном поле. 6. Интерференционная микроскопия 7. Поляризационная микроскопия. 8. Электронная микроскопия. 17
Микроскоп n Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает: штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубусодержатель. 18
Специальые методы микроскопирования: - фазовоконтрастный микроскоп - (для изуч. живых неокраш-х обьектов)- микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. - темнопольный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов). Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. 19
Специальые методы микроскопирования люминесцентный мик-п (для изуч. живых неокраш-х обьектов) микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. -ультрафиолетовый способность м-па) мик-п (повышает разрешающую -поляризационный мик-п (для иссл. обьектов с упорядочонным располажением молекул - скелет. муск-ра, коллагеновые волокна и т. д.) микроскопия – формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы). 20
Специальые методы микроскопирования -интерфекренционная микроскопия (для опред-я сухового остатка в клетках, определение толщины обьектов) - микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом. В. Электронная микроскопия: -трансмиционная (изучение обьектов на просвет) -сканирующий (изучение поверхности обьектов) Теоретически разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0, 002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0, 1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм. 21
Специальые методы микроскопирования Просвечивающий электронный микроскоп состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки. Сканирующий электронный микроскоп применяют для получения трёхмерного изображения поверхности исследуемого объекта. Метод сколов (замораживание-скалывание) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. 22
Специальные (немикроскопические) методы: 1. Цито- или гистохимия - суть заключается использовании строгоспецифических химических реакций с светлым конечным продуктом в клетках и тканях для определения количества различных веществ(белков, ферментов, жиров, углеводов и т. д.). Можно применить на уровне светового или электронного микроскопа. 2. Цитофотометрия - метод применяется в комплексе с 1 и дает возможность количественно оценить выявленные цитогистохимическим методом белки, ферменты и т. д. 3. Авторадиография - вводят в организм вещества, содержащие радиоактивные изотопы химических элементов. Эти вещества включаются в обменные процессы в клетках. Локализацию, дальнейшие перемещения этих веществ в органах определяются на гистопрепаратах по излучению, которое улавливается фотоэмульсией, нанесенной на препарат. 4. Рентгентоструктурный анализ - позволяет определить количество химических элементов в клетках, изучить молекулярную структуру биологических микрообьектов. 24 5. Морфометрия - измерение размеров биол. структур на клеточном и субклеточном уровне.
Специальные (немикроскопические) методы 6. Микроургия - проведение очень тонких операций микроманипулятором под микроскопом (пересадка ядер, введение в клетки различных веществ, измерение биопотенциалов и т. д.) 6. Метод культивирования клеток и тканей - в питательных средах или в диффузионных камерах, имплантированных в различные ткани организма. 7. Ультрацентрофугирование - фракционирование клеток или субклеточных структур путем центрофугирования в растворах различной плотности. 8. Экспериментальный метод. 9. Метод трансплантации тканей и органов. 25
Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания. 32
Фиксирующая жидкость формалин, спирты, глутаральдегид - Наиболее распространённые фиксаторы; Криофиксация - Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (– 196 °С); Лиофилизация – небольшие кусочки ткани подвергаются быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Обезвоживание- стандартная процедура удаления воды-обезвоживание в спиртах, возрастающей крепости (от 70 до 60%). Заливка – делает ткань прочной, предотвращает её раздаваливание и сминание при резании, дает возможность получать срезы стандартной толщины. Наиболее распространенная среда для заливки – парафин. Используют также – целлоидин, пластически среды и смолы. 33
Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в неё сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующих смесей (большинство фиксаторов – водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды – обезвоживание в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости. 34
Заливка – необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает её раздавливание и сминание при резании, даёт возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространённая среда для заливки – парафин. Используют также целлоидин, пластические среды и смолы. 35
Ротационный микротом. 40 n Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования.
Методы окраски гистосрезов: n Ядерные (основные): n гематоксилин – окрашивает n n n n ядра в синий цвет; железный гематоксилин; азур II (в фиолетовый); кармин (в красный); сафранин (в красный); метиловый синий (в синий); толуидиновый (в синий); тиониновый (в синий). n Цитоплазматические- (кислые): n эозин – в розовый; n эритрозин; n оранжевый «G» ; n кислый фуксин –в красный; n пикриновая кислота - в желтый; n конго –красный – в красный 44
СПЕЦИАЛЬНЫЕ Методы окраски гистосрезов n Судан III –окраска липидов и жиров в оранжевый цвет; n осмиевая кислота – окраска липидов и жиров в черный цвет; n орсеин -окраска эластических волокон в коричневый цвет; n азотнокислое серебро – импрегнация нервных элементов в темнокоричневый цвет. 45
Структуры клеток: n ОКСИФИЛИЯn способность окрашиваться кислыми красителями в розовый цвет n Базофилияn способность окрашиваться основными красителями в синий цвет n Нейтрофилия – n способность окрашиваться кислыми и основными красителями в фиолетовый цвет. 47
1
Клетка n - это элементарная живая система, состоящая из цитоплазмы, ядра, оболочки и являющаяся основой развития, строения и жизнедеятельности животных и растительных организмов.
Гликокаликс- надмембранный комплекс, состоит из сахаридов, связанных с белками и сахаридов, связанных с липидами. Функции n Рецепция (гормоны, цитокины, медиаторы и антигены) n Межклеточные взаимодействия(раздражимость и узнавание) n Пристеночное пищеварение (микроворсинки каемчатых клеток кишечника)
Функции цитолеммы: - разграничительная; - активный и пассивный транспорт веществ в обе стороны; - рецепторные функции; -контакт с соседними клетками.
Гистологические методы исследования
применяются для изучения строения и функции клеток и тканей человека, животных и растительных организмов в норме, патологии и эксперименте. Основой Г. м. и. является - комплекс методических приемов, используемых при изготовлении препаратов клеток и тканей для их микроскопического исследования. Микроскопическое изучение клеток и тканей может проводиться двумя основными путями в зависимости состояния исследуемого объекта: исследование живых клеток и тканей, исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих структуру благодаря специальным приемам фиксации. Изучение живых объектов - витальное (суправитальное) - дает возможность наблюдать физиологические процессы в клетках и тканях, их прижизненное строение. Оно проводится на клетках, свободно взвешенных в жидкой среде (клетках крови, эпителиальных клетках соскобов и др.), а также на культурах клеток и тканей, выращенных на специальных питательных средах. Объектом прижизненного наблюдения могут быть тонкие, прозрачные тканевые пленки ( , плавательная перепонка). В экспериментальных исследованиях используется метод биологических окон (вживление прозрачных камер) и изучение тканевых имплантатов в естественной прозрачной среде, например в передней камере глаза животных. В зависимости от поставленной задачи при витальных исследованиях применяются различные специальные методы микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, флюоресцентная, поляризационная, ультрафиолетовая. Витальные гистологические методы применяются в основном для биологических и медико-биологических исследований. Их широкое применение ограничено большими техническими трудностями, связанными со свойствами переживающих тканей. В медицинских исследованиях, особенно в практике патолого-анатомических лабораторий, используются методы исследования фиксированных объектов. Цель фиксации сохранить прижизненную структуру клеток и тканей путем быстрого воздействия на них химическими агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений.
Выбор метода фиксации зависит от задач исследования и особенностей фиксируемого материала. Так, для выявления тонких клеточных структур применяют фиксирующие смеси, содержащие соли тяжелых металлов (например, сулему) Лучшим фиксатором для цитологических целей служит четырехокись осмия, часто используемая и электронной микроскопии. Универсальным фиксатором является формальдегид, применяемый в виде 10% раствора формалина. Чтобы была равномерной и полной, кусочки ткани должны быть небольшими, а объем фиксирующей жидкости - во много раз превосходить объем фиксируемого материала. По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты тканей (например, отложения солей кальция) удаляют с помощью методов декальцинации. Наиболее быстрым и простым способом приготовления среза ткани, применяемым обычно при экспресс-диагностике, является кусочка и получение срезов ткани на замораживающем микротоме. Однако при этом трудно получить достаточно тонкие срезы, а также срезы с мелких объектов и распадающихся тканей. Поэтому кусочки тканей, как правило, заливают в уплотняющие среды - или целлоидин. Фиксированную обезвоживают в спиртах возрастающей крепости, проводят через промежуточный растворитель (ксилол или для парафина, спирт-эфир для целлоидина) и пропитывают парафином или целлоидином. в парафин позволяет получить более тонкие срезы (от 5-8 до 1-2 мкм
), чем в целлоидин. Срезы для микроскопического исследования приготавливают с помощью санного или роторного микротомов. Сверхтонкие срезы (толщиной от 90-100 до 5-15 нм
), необходимые для электронно-микроскопических исследований, готовят на ультратоме. Ультратомы используют и в световой микроскопии для получения полутонких срезов. Приготовленные срезы окрашивают для четкого выделения структур клеток и тканей, которые по-разному воспринимают красители. Основные красители - красящие основания и их соли ( , толуидиновый синий, азуры, бисмарк коричневый) - окрашивают так называемые базофильные структуры (ядра клеток, соединительной ткани). Кислые красители - красящие кислоты и их соли (пикриновая кислота, эритрозин) - окрашивают ацидофильные, или оксифильные, структуры (цитоплазму клеток, коллагеновые, эластические волокна). окраски следует отличать импрегнацию - специальный метод, основанный на определенных участков клеток и тканей восстанавливать тяжелые металлы (например, серебра, золота, осмия) из их солей и за счет этого приобретать интенсивную окраску. Приготовление гистологического препарата завершается заключением его в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этих целей применяют органические смолы, например .
1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .
Смотреть что такое "Гистологические методы исследования" в других словарях:
Методические подходы и методы исследования в анатомии человека - Иногда приходится слышать о том, что в анатомии уже ничего не осталось для изучения, исследования, якобы все темы исчерпаны, все, что можно было изучать, уже изучено, все вопросы решены. Как будто бы все, что касается строения тела человека,… … Словарь терминов и понятий по анатомии человека
ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. см. ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Важнейшим условием получения достоверных результатов исследований является правильный выбор объектов анализа, своевременный их отбор и формулировка задачи исследования. Правила отбора проб … Болезни рыб: Справочник
I Медицина Медицина система научных знаний и практической деятельности, целями которой являются укрепление и сохранение здоровья, продление жизни людей, предупреждение и лечение болезней человека. Для выполнения этих задач М. изучает строение и… … Медицинская энциклопедия
Способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет… … Медицинская энциклопедия
- (гистологическое cytus клетка + греч. logos учение) основано на изучении с помощью микроскопа особенностей строения клеток, клеточного состава органов тканей, жидкостей организма человека и животных в норме и при патологических процессах. Ц. и.… … Медицинская энциклопедия
I Гистология (греч. histos ткань + logos учение) медико биологическая наука, изучающая эволюцию тканей, их развитие в организме (гистогенез), строение, функции и взаимодействие у многоклеточных животных и человека. Основной предмет изучения Г.… … Медицинская энциклопедия
I Вульва (vulva; pudendum femininum) наружные женские половые органы (по Международной анатомической номенклатуре женская половая область). Анатомия и физиология. Вульва (рис. 1) расположена снаружи от лобковых костей таза и прикрепленной к ним… … Медицинская энциклопедия
Изучая изменения, вызванные в организме различными болезненными процессами, имеет целью присущими ей методами исследования как определение этих болезненных процессов, так и значение их по отношению к клинической картине болезни и смертельному… … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона
I Биопсия (греч. bios жизнь + opsis зрение, зрительное восприятие) прижизненное взятие тканей, органов или взвеси клеток для микроскопического исследования с диагностической целью, а также для изучения динамики патологического процесса и влияния… … Медицинская энциклопедия
Наука, занимающаяся изучением тканей животных. Тканью называют группу клеток, сходных по форме, размерам и функциям и по продуктам своей жизнедеятельности. У всех растений и животных, за исключением самых примитивных, тело состоит из тканей,… … Энциклопедия Кольера
- (от греч. ἱστός ткань и греч. λόγος знание, слово, наука) раздел биологии, изучающий строение тканей живых организмов. Обычно это делается рассечением тканей на тонкие слои и с помощью микротома. В отличие от анатомии,… … Википедия
Книги
- Множественная миелома и плазмоклеточные заболевания , Рамасами Картик, Лониал Сагар. В книге представлены основные клинические аспекты множественной миеломы и других плазмоклеточных заболеваний. Описаны лабораторные исследования, патогенез, диагностика и лечение. Во втором…
Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные - неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.
Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии - в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду - парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) - для электронно-микроскопического исследования.
Существуют также физические способы фиксации материала , наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы - криостаты, или замораживающие микротомы.
Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии , не должна превышать 4-5 мкм, для электронной - 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).
После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).
По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.
Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа - это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии - фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.
Фазово-контрастная микроскопия - метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.
Интерференционная микроскопия . В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются - один пучок проходит через объект, другой - идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.
Поляризационная микроскопия . В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).
Современные методы исследования тканей и клеток используют достижения физики, химии, биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии. Это стало возможным в связи с созданием новых приборов и технологий – различных типов микроскопов, компьютерной техники, рентгеноструктурного анализа, авторадиографии, электрофореза и хроматографии, разделение и культивирование клеток, получение гибридов и гибридом и др. Однако, несмотря на такие разнообразные методы, гистология в своей основе является морфологической наукой, объектами исследования которой служат живые и фиксированные клетки и ткани.
Основными методами изучения строения животных и растительных клеток и тканей является световая микроскопия. Современные световые микроскопы обеспечивают разрешение (возможность наблюдать две точки раздельно) порядка 0,2 мкм и дают максимальное увеличение в 2000-2500 раз. Для контрастности микрообъектов их окрашивают после фиксации. Фиксация сводится к закреплению прижизненного строения исследуемого объекта.
К фиксирующим средствам относят формалин (5-20%), этиловый спирт, осьмиевую кислоту.
Окрашивание производят различными методами в зависимости от задач исследования.
К световой микроскопии относят фазово-контрастную, флуоресцентную, ультрафиолетовую, интерференционную и микроскопию в темном поле.
Фазово-контрастная микроскопия используется для исследования прозрачных бесцветных живых объектов (клеток и тканей). Этот метод обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. В результате становятся видны в черно-белом изображении все структуры, различающиеся по показателю преломления.
Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. При флюоресценции атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход в нормальное состояние происходит с испусканием света, но с большей длиной волны.
Препарат просматривают в ультрафиолетовых или фиолетовых и синих лучах.
Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80ºС.
Вторичная флюоресценция вызывается специальными красителями – флюорохромами (акриноранжевый, родамин, флюорецин и др.). Например, при обработке препаратов акриновым оранжевым ДНК в клетке имеет ярко-зеленое, а РНК – ярко-красное свечение.
Ультрафиолетовая микроскопия основана на применении коротких ультрафиолетовых лучей с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние при этом составляет 0,1 мкм. Изображение регистрируется на фотопластинке или на люминесцентном экране.
Микроскопия в темном поле . Используется специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на темном поле. Используется этот метод для наблюдения живых объектов, для изучения кристаллов в моче.
Интерференционная микроскопия. Для количественного определения массы ткани используется интерференционный микроскоп, а для изучения рельефа поверхности клеток – дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского).
В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект, другой минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. При этом участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. После количественной оценки изменений определяют концентрацию и массу сухого вещества. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и деления (митоз, мейоз).
Поляризационная микроскопия является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра: один (поляризатор) между пучком света и объектом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменять направление пучка света.
При этом проявляется свойство некоторых органических структур по разному преломлять поляризованный свет вдоль различных оптических осей в связи с особой ориентацией своих молекул (анизотропия). Например, коллагеновые волокна и миофибриллы при изменении оси вращения фильтров проявляются как светящиеся.
Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используется поток электронов в вакууме с более короткими, чем в световом микроскопе длинами волн. При напряжении в 50000В длина волны электромагнитных колебаний равна 0,0056 нм.
Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть 0,002 нм, т.е. в 100000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Однако практически оно составляет 0,1-0,7 нм. В настоящее время в гистологических исследованиях используют трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ). Просвечивающие электронные микроскопы позволяют получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта, а сканирующие способны создавать трехмерное изображение, т.е. последовательно прощупывают электронным пучком отдельные точки поверхности.
Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.
Для изучения деталей строения мембран и межклеточных контактов применяется метод замораживания – скалывания (-160ºС). Метод электронной микроскопии «замораживание» - травление применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После замораживания блок раскалывают кристаллы льда, удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем на участки клеток напыляют тонкую пленку тяжелого металла (например, платины).
Методы замораживания позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксатором.
Сверхвысоковольтная микроскопия. Электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3000000В позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм).
Для изучения структуры макромолекул на атомарном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину волны около 0,1нм (диаметр атома водорода).
Существует множество методов исследования , среди которых выделяются следующие: наблюдение за живыми зародышами с применением кино- и видеосъемки (используется в основном в эксперименте). Для этого применяется специальная микрофотоустановка, соединяющаяся с термокамерой, в которой развивается зародыш. При изучении развития куриного эмбриона, например, в скорлупе проделываете» окошечко, которое закрывается прозрачной пластинкой. Данный метод позволил проследить и уточнить динамику изменения формы и размеров зародышей в процессе развития.
Метод изучения фиксированных срезов зародышей с помощью световой и электронной микроскопии, гисторадиоавтографии, гисто- и иммуноцитохимии. Эти методы позволяют анализировать тканевые и внутриклеточные изменения в динамике развития частей зародыша. С помощью гисто- и иммуноцитохимических методов исследуются биохимические процессы, происходящие в клетках зародышей, - синтез ДНК, РНК, белков, специфических рецепторных белков и др. С применением этих методов была получена важная информация о клеточной и тканевой дифференцировке в развитии эмбрионов и плодов.
Метод маркировки , предложенный в 1925 г. В. Фогтом (1888-1941), позволяет изучать перемещения клеток в развивающемся зародыше. Для этого применяются нетоксичные для зародышей маркеры (например, нейтральный красный, частицы древесного угля), а также антитела к определенным белкам. При применении антител используется их свойство соединяться с флюоресцирующим красителем и белками зародыша. С помощью флюоресцентной микроскопии прослеживается распределение красителя и исследуется динамика белкового синтеза в развивающихся тканях зародыша.
Методы микрохирургии разрабатывались в начале XX века представителями школы Г. Шпемана (1869-1941). Они включали: снятие оболочек яиц животных, пересадку частей одного зародыша другому и др. Данные методы используются также для изучения последствий разрушения (например, с помощью лазерного луча) частей зародыша или его отдельных клеток. Трансплантацию как разновидность микрохирургии используют для выявления путей миграции клеток и источников развития тканей. При этом пересаживают участок зародыша, например перепела, в тот же участок куриного зародыша на место удаленного участка. Ядра клеток перепела имеют характерную структуру и поэтому отличимы от ядер клеток зародыша курицы.
Эксплантация - иссечение небольшого участка зародыша и выращивание его на искусственной среде. С помощью этого метода можно получать информацию об источниках развития тканей из данного участка зародыша и выявлять гистогенетические закономерности развития.
Трансплантация ядер - метод, позволяющий клонировать зародышей. Например, пересадка ядер из клеток эпителия кишки головастика шпорцевой лягушки в икринку лягушки, ядро которой было инактивированно ультрафиолетовым лучом, привела к появлению новых особей (опыты Гердон). Данные опыты заложили основу клонирования высших позвоночных и способствовали появлению (в 1997 г.) знаменитой овцы Долли. Подобные эмбриологические эксперименты убедительно показали, что ядра соматических клеток содержат полный набор генетической информации для развития нового организма.
Новейшим достижением экспериментальной эмбриологии явилась разработка метода экстракорпорального оплодотворения. Пересадка зародышей, зачатых в пробирке, в матку составляет основу лечения бесплодия. В 1973 г. Л. Шеттлз (США) извлек предовуляторную яйцеклетку из яичника бесплодной женщины и оплодотворил ее сперматозоидами мужа. Так было положено начало технике пересадки зародышей человека с целью лечения бесплодия. Однако только в 1978 г. в Великобритании в результате успешной пересадки в матку бесплодной женщины зародыша человека на стадии 8 бластомеров после 2,5 суток культивирования появился первый в мире "пробирочный" ребенок массой 2700 г.